Studie en evaluatie van carcinogenese

Carcinogenese wordt bestudeerd met verschillende gestandaardiseerde toxicologische tests. Een eerste deel van deze testen wordt in vitro uitgevoerd en - indien ze positief zijn - gaan we over tot een in vivo experiment. Deze experimentele stapsgewijze benadering wordt DECISION POINT APPROACH genoemd, een reeks proeven die aan het einde van elke proef stoppen om te beslissen hoe verder te gaan met de proef. Er zijn vijf fasen:

FASE A: structuur en kenmerken van de kankerverwekkende stof;

FASE: in deze fase van kortdurende in vitro testen worden zoogdiercellen gebruikt. De meest gebruikte cellen zijn hepatocyten, omdat de mate van herstel van de schade die de hepatocyt ontwikkelt volgens de ernst van de schade die door de stof wordt veroorzaakt, wordt bestudeerd. In een notendop, we bepalen niet de schade op zich, maar hoeveel van het reparatiesysteem is geactiveerd door de levercel.

De geïmplementeerde procedure is om 3 hepatocytculturen te vormen.In de eerste kweek zijn de hepatocyten gezond, in de tweede worden ze behandeld met de teststof en ten slotte in de derde worden ze behandeld met een controlestof die zeker kankerverwekkend is. Deze drie culturen bevatten een radioactieve pyrimidinebase, getritieerd thymidine, dat als een marker fungeert.

Als de onderzochte verbinding een mutatie in het DNA veroorzaakt, reageert de cel op dit probleem door de reparatiesystemen te activeren. Het stukje DNA dat de mutatie heeft ondergaan wordt geknipt en dankzij de werking van de DNA-polymerase wordt het ontbrekende stukje vervangen door een nieuw.Voor de correctie gebruikt het DNA-polymerase de nieuwe basen, waaronder getritieerd thymidine.Er wordt een radioactieve base ingebouwd. De analyse van radioactiviteit bepaalt de mate van mutatie in de behandelde cellen: hoe hoger de radioactiviteit, hoe groter de DNA-mutaties.

Ook in fase B wordt er getest op bacteriën, om te kunnen onderzoeken of er sprake is van omgekeerde mutaties. De gebruikte bacteriën zijn salmonella's die al drager zijn van mutaties. De mutatie betreft de synthese van histidine, waardoor salmonella's niet kunnen groeien zonder histidine. Deze bacteriekolonies worden deels genomen om te worden behandeld met de teststof, deels voor de negatieve controle en deels voor de positieve controle, en vervolgens getest met een bekend carcinogeen. Als deze teststof indirect genotoxisch is, moeten metaboliserende enzymen in het kweekmedium worden geïntroduceerd. Op dit moment zijn er 3 culturen die zullen worden gezaaid en gekweekt in petrischalen (er is geen histidine in het kweekmedium).Als er geen mutaties zijn door het te testen kankerverwekkende middel, zouden er in theorie geen mutaties op de platen moeten zijn Als er een mutagene werking van het carcinogeen was, kan het de eerste mutatie hebben veranderd en een tweede mutatie hebben gecreëerd die in staat is om de bacteriën op het histidinevrije kweekmedium te laten groeien. In dit geval de tweede mutatie die de eerste mutatie wijzigt en neemt de naam RETROMUTATION Ten slotte, als er een significante groei optreedt in de piasta petri, is het carcinogeen direct.
Altijd met een in vitro test is het mogelijk om de chromosomale integriteit te bepalen. Deze test wordt altijd uitgevoerd op zoogdiercellen en wordt gebruikt om toxische stoffen te testen die mutaties kunnen veroorzaken op sommige enzymen die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese van DNA. De te testen stof wordt onderworpen aan in vitro analyse Om te kunnen bepalen of de onderzochte stof de integriteit en het aantal aanwezige chromosomen aantast, wordt de micronucleustest gebruikt. De micronuclei zijn blaasjes die worden gevormd met een deel van het chromatine erin. Het chromatine dat in deze micronuclei is opgenomen, kan ofwel hele chromosomen zijn of fragmenten van chromosomen. De micronuclei worden gevormd door de verkeerde celdeling waardoor dochtercellen ontstaan met genetisch materiaal dat niet gelijk is Het resultaat van deze test is de bepaling van stoffen die gedefinieerd zijn als clastogeen en spoelgif. De clastogene stof produceert micronuclei met acentrische fragmenten van chromosomen, zodat de stof een breuk in de chromosomen veroorzaakt, in plaats daarvan produceert de giftige stof van de spoel van de micronuclei waarin zich hele chromosomen bevinden.
Als de onderzochte stof genotoxiciteit induceert in een of meer tests, wordt dit gedefinieerd als zeer verdacht, dus gaat het rechtstreeks naar fase D. Als de geteste stof daarentegen geen genotoxische effecten heeft, gaat het over naar de onderzoeksfase C omdat het een promotor kan zijn.

FASEC: in deze fase kunnen zowel in vitro als in vivo tests worden uitgevoerd.

Voor in vitro-tests kon worden aangetoond dat de promotorstof de spleetovergangen tussen normale cellen en tumorcellen kan verbreken, met als gevolg de passage van stoffen tussen de twee cellen.

Een in vivo test is de inductie van huidtumoren bij muizen. De te testen stof wordt twee of drie keer per week op de huid van de muis aangebracht. Als deze stof een promotor is, kunnen er binnen 2/3 maanden papillomavormingen zijn. Bij muizen worden twee hoofdgegevens in aanmerking genomen: het aantal muizen dat is aangetast door papillomen en het aantal papillomen dat op elk dier aanwezig is. Als de stof als promotor werkt en een tumor ontwikkelt bij de behandelde muis, betekent dit dat het inderdaad een stof is met een promotorwerking.

Zodra deze tests zijn voltooid, gaan we over op in-vivotests op lange termijn.

FASED: in deze fase worden alle verbindingen getest die mutageen blijken te zijn en alle verbindingen die niet mutageen blijken te zijn. De tests die kunnen worden uitgevoerd, zijn verschillend, waarvan sommige tests worden uitgevoerd op de lever, op de longen en ten slotte op de borst.

De levertest toont de vorming aan van niet een nieuw gevormde tumor, maar van een neoplastische focus, dus iets dat zich voorbereidt om een tumor te worden. De cellen van deze focus zijn al atypische cellen, daarom hebben ze een mutatie ondergaan en bereiden ze zich voor om neoplastische cellen te worden. Na een bepaalde tijd wordt dankzij het autopsieonderzoek de vorming van pre-neoplastische focussen bepaald door het aantal en de omvang van deze pre-neoplastische formaties te berekenen.

De longtest maakt de bepaling van een adenoom mogelijk, wat een "afwijking van de cellen van het longweefsel is. Ook in dit geval wordt het longweefsel van de rat na een vrij lange tijd (maanden) onderzocht (deze adenomen zijn gemakkelijk te herkennen omdat zijn witachtige knobbeltjes op het longepitheel).
De borsttest maakt de bepaling van tumoren in het klierweefsel mogelijk. Het aantal gevormde adenomen en het aantal dieren dat adenomen vertoont, wordt altijd geëvalueerd.

Als er positieve resultaten zijn van deze tests, is de teststof echt kankerverwekkend. Op dit punt gaan we over op het uitvoeren van dure tests met zeer lange uitvoeringstijden.

FASE: in deze fase wordt een variabel aantal dieren, van 20 tot 50, onderworpen aan langdurige tests, die erg duur zijn en lang duren voordat bepaalde resultaten worden verkregen; we spreken over ongeveer 1/8 van het leven van het dier.Het is mogelijk dat tijdens het proces van deze tests sommige dieren sterven, maar ze worden altijd bestudeerd met autopsie en histologisch typeonderzoek. De gekozen dieren zijn altijd ratten en muizen en slechts 70-80% overleeft tot het einde van de langetermijntests. De gebruikte dieren zijn net gespeend, want hoe jonger ze zijn, hoe gevoeliger ze zijn voor behandelingen. Tijdens de langdurige testperiode wordt de onderzoeker altijd ondersteund door een wiskundige-statisticus, die in staat is om alle verzamelde informatie in aanmerking te nemen en de verschillende gegevens te reproduceren.

De op dieren geteste doses gaan uit van de maximaal getolereerde dosis en al zijn subveelvouden, en de dosis-responsreactie bij het dier wordt geëvalueerd.
Toediening moet altijd de route benaderen waarlangs de man in contact kan komen met de onderzochte stof, dus de orale, cutane of respiratoire route, terwijl als de kankerverwekkendheid van een geneesmiddel wordt getest, het ook nuttig is om intraveneuze toediening uit te voeren.
De geteste groepen dieren zijn 4 (50 dieren voor elke groep):

Een NAIF-groep die geen behandeling heeft;
Een groep behandeld met het voertuig;
Een groep behandeld met de teststof;
Een groep die is behandeld met een bekend carcinogeen.

Het is heel belangrijk dat het aantal dieren in elke groep zo gelijk mogelijk is, want als er te veel verschil is in het aantal dieren, kan de statistische test vals blijken te zijn.
De evaluaties die worden uitgevoerd zijn:

Totale frequentie van tumoren;
Frequentie van sommige tumoren;
Frequentie van dieren met meer dan één type tumor;
Aantal kankers bij dieren.

Aan het einde van al deze studiefasen wordt de stof ingedeeld in een ranglijst die is opgesteld door het IARC (International Agency for Research and Development on Cancer) en door de Environmental Protection Agency (EPA).